乌菲兹美术馆的兴建始于1560年。这里一开始是乔尔乔·瓦萨里为第一代托斯卡纳大公，科西莫一世·德·美第奇所建的办公室（Uffizi和意大利语“办公室”谐音）。整个庞大的宫殿式建筑直到1581年才完工。

从科西莫一世开始，美第奇家族就热衷于艺术，并一直有赞助许多大师，如达芬奇，米开朗基罗等。家族世世代代收藏的艺术品也大都安放与此。家族的最后一位直系后裔安娜·玛丽亚·美第奇在临终时留下遗言，把美第奇家族所有的藏品都捐赠给托斯卡纳政府，并作为佛罗伦萨的遗产保留下来。乌菲兹也很自然地成为了一所博物馆，并于1765年正式对公众开放。

由于馆藏实在太多，一些藏品不得不转移到佛罗伦萨的其他博物馆中。比如一些有名的雕塑作品就被安放在了巴杰罗美术馆。乌菲兹从2006年开始进行扩建工程，预计2011年完工。扩建之后展馆面积将由6000平方米增至约13000平方米。使得许多过去放在储藏室里的作品得以公开展览。

在1993年，一起汽车炸弹爆炸事件，造成了美术馆部分破坏。损坏最严重的是Niobe厅：部分壁画被完全损毁，一些雕塑需要修复。 在2007年8月，佛罗伦斯的一场大暴雨使得部分展厅严重漏水，游客需要疏散。

今天，乌菲兹已成为佛罗伦斯最受欢迎的旅游点。在旺季时，尤其是7月间，排队等候进馆的时间会非常久。